Las Terapias Dirigidas Por el Huésped Contra el SARS-CoV-2 de linaje Temprano Conservan la Eficacia Contra la Variante B.1.1.7 .
Introducción
El síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), el agente causante de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), se ha extendido por todo el mundo causando millones de muertes y trastornos sociales y económicos masivos. En septiembre de 2020, se detectó una nueva variante de SARS-CoV-2 en el Reino Unido (Reino Unido), conocida como linaje B.1.1.7. Esta variante se ha extendido rápidamente desde noviembre de 2020 en todo el Reino Unido y ahora comprende hasta el 40% de los casos nuevos de COVID-19 en el sureste de Inglaterra (Public Health England, tercer informe técnico). Fundamentalmente, B.1.1.7 también se ha detectado en numerosos países de todo el mundo, incluidos los Estados Unidos, Europa y Canadá. Número de infecciones B.1.1.7 en rápido aumento y B.1.1.
La secuenciación de la variante B.1.1.7 reveló 23 mutaciones ( Rambaut et al., 2020 ); 17 mutaciones que codifican proteínas (14 mutaciones no sinónimas y 3 deleciones) y 6 mutaciones sinónimas (Figura 1). La mayoría de las mutaciones codificadoras de proteínas (8) se observaron dentro de la proteína Spike viral, que facilita la entrada viral a través de su interacción con el receptor ACE2 humano. Informes recientes han sugerido que los cambios en Spike, especialmente en el dominio de unión al receptor (RBD), encontrados en nuevas variantes de SARS-CoV-2 pueden alterar la sensibilidad de neutralización de anticuerpos y posiblemente la eficacia de la vacuna ( Collier et al., 2021 ; R eese-Spear et al. . al, 2021 ), aunque esto no parece ser cierto para la mutación N501Y de Spike RBD de la variante B.1.1.7 ( Muik et al., 2021 ; Rathnasinghe et al, 2021). Las otras mutaciones no sinónimas se encuentran en la proteína Nsp3 (3), Nsp6 (1), Orf8 (3) y N (2). El impacto de estas mutaciones en la replicación, transmisión y patogénesis viral aún no se comprende bien. Es fundamental investigar el impacto de estas mutaciones en el ciclo de vida viral y evaluar la eficacia de los tratamientos antivirales candidatos previamente identificados para COVID-19 en esta nueva variante del SARS-CoV-2.
A) Mapa del genoma del SARS-CoV-2 (NC_045512.2) que representa marcos de lectura abiertos (flechas violetas oscuras) y proteínas resultantes de la escisión del polipéptido ORF1ab en proteínas no estructurales (violeta claro). Se anotan 17 mutaciones que codifican proteínas (arriba) que incluyen 14 mutaciones no sinónimas y 3 deleciones que abarcan 5 proteínas virales. B) Expansión de la región genómica de la espiga a la proteína N con fines de visualización.
Actualmente, solo las intervenciones inmunosupresoras como la dexametasona han tenido éxito en la reducción de la mortalidad en casos graves de COVID-19 ( RECOVERY Collaborative Group et al., 2020 ). Sigue existiendo una necesidad urgente de probar y desarrollar nuevas intervenciones terapéuticas para el tratamiento clínico que se dirijan tanto a la replicación viral como a la inmunopatología asociada con un mal pronóstico. Las terapias dirigidas al huésped ofrecen ventajas sobre las que se dirigen directamente al virus, ya que los genes del huésped poseen una menor propensión a mutar y presentan una barrera más alta para la adaptación viral que implica interacciones con cofactores esenciales del huésped. Además, las dianas de hospedadores que pueden administrarse medicamentos a menudo juegan un papel en otras enfermedades, brindando la oportunidad de reutilizar medicamentos aprobados por la FDA y acelerar los plazos de desarrollo de medicamentos.
Anteriormente, nosotros y otros hemos identificado varios factores del hospedador que interactúan directamente con las proteínas del SARS-CoV-2 ( Gordon, Hiatt, et al., 2020 ; Gordon, Jang, et al., 2020 ), o se ven afectados durante el curso de la infección viral. infección ( Bouhaddou et al., 2020 ). Muchos de estos factores del hospedador están dirigidos por medicamentos aprobados por la FDA, nuevos medicamentos en investigación (IND) o compuestos preclínicos, y han demostrado fuertes efectos antivirales. Por ejemplo, descubrimos que el factor de traducción eucariota eIF4H interactúa con el SARS-CoV-2 Nsp9 e identificamos inhibidores de la maquinaria de traducción eucariota como potentes antivirales contra el SARS-CoV-2, incluida la zotatafina (inhibidor de eIF4A) y la ternatina-4 (inhibidor de eEF1A), un derivado molecular de plitidepsina (aplidina) (Gordon, Jang, et al., 2020 ). La plitidepsina, otro inhibidor de eEF1A aprobado clínicamente en algunos países para tratar el mieloma múltiple ( Leisch et al., 2019 ), poseía una potente actividad antiviral en varias líneas celulares, células primarias y modelos de ratón ( White et al., 2021 ). Además, la inhibición farmacológica de la señalización de p38 utilizando ralimetinib y otros inhibidores de p38 demostró una fuerte actividad antiviral, consistente con un marcado aumento en la actividad de la p38-MAP quinasa durante la infección por SARS-CoV-2 ( Bouhaddou et al., 2020). Aquí, mostramos que plitidepsina, ralimetinib y remdesivir (un análogo de nucleósido antivírico de amplio espectro ampliamente utilizado aprobado para su uso en varios países para el tratamiento de COVID-19) poseen eficacia antiviral contra la variante del virus B.1.1.7.
Resultados / Discusión
Primero tratamos las células Caco-2 del epitelio intestinal con un rango de concentraciones de plitidepsina, ralimetinib o remdesivir antes de la infección por el SARS-CoV-2 de linaje temprano BetaCoV / Australia / VIC01 / 2020 (VIC) o el B.1.1.7 variante (SARS-CoV-2 England / ATACCC 174/2020 aislado) durante 24 horas. La plitidepsina suprimió de forma potente la replicación viral de ambas cepas de SARS-CoV-2 en el rango nanomolar, medida mediante células positivas a la proteína nucleocápside intracelular (% de células N +) mediante citometría de flujo (Figura 2 A) así como la replicación del ARN viral medida por acumulación de ARN E genómico y subgenómico por RT-qPCR (Figura 2 B). También se observó inhibición de la replicación viral con ralimetinib, inhibidor de la dirección p38, con efectos antivirales que se manifiestan a concentraciones de fármaco μM (Figura 2 D y yE).mi). No observamos citotoxicidad en el rango de concentraciones utilizadas para cada inhibidor mediante el ensayo MTT (Figura 2 C y y F).F). Remdesivir, un inhibidor de la polimerasa (Kovic, 2020), se usó como control positivo y también inhibió la replicación de ambos virus de una manera dependiente de la dosis en el rango μM (Figura 2H), como se observó en otros lugares ( Thorne et al., 2020 ), sin citotoxicidad observada (Figura 2 I). Sorprendentemente, la plitidepsina fue eficaz contra los linajes iniciales y más recientes del SARS-CoV-2 en concentraciones de un orden de magnitud inferior al remdesivir.
BetaCoV / Australia / VIC01 / 2020 (VIC) o SARS-CoV-2 B.1.1.7 (SARS CoV 2 England / ATACCC 174/2020) replicación después del tratamiento con dosis crecientes de plitidepsina inhibidor de eEF1A, ralimetinib inhibidor de p38 o viral inhibidor de la replicación remdesivir. ( A , D , G ) Los niveles de infección en presencia de plitidepsina (A), ralimetinib (D) o remdesivir (G) se midieron mediante tinción intracelular para la proteína de la nucleocápsida (N +) del SARS-CoV-2 a las 24 h después de la infección. ( B , E , H ) Se muestra la replicación de ARN E genómico y subgenómico de SARS-CoV-2 por μg de ARN total medido por qRT-PCR. ( C , F , yo) La viabilidad celular en ausencia de infección después de la exposición a las concentraciones de inhibidor indicadas se muestra en relación con los controles tratados con DMSO. Las líneas discontinuas indican la replicación viral en presencia de control de vehículo DMSO. Media +/− SEM (n = 3).
Para confirmar que ambos fármacos dirigidos al huésped retuvieron actividades en células competentes de detección innata, probamos su efecto sobre la infección por SARS-CoV-2 en células epiteliales de pulmón humano Calu-3. Esta línea celular es altamente permisible para la infección por SARS-CoV-2, mientras genera una fuerte respuesta inmune innata inflamatoria ( Thorne et al. 2020 ) similar a la observada en las células primarias de las vías respiratorias humanas (Ravindra et al. 2020). Probamos la concentración no tóxica más alta (> 75% de viabilidad celular) de cada fármaco (Figura 3 A, ,RE,re, ,GRAMO),GRAMO), Plitidepsina 6 nM, ralimetinib 6,7 μM y remdesivir 1,1 μM, contra ambos linajes SARS-CoV-2. De forma similar a lo que observamos en las células Caco-2, la plitidepsina retuvo los efectos antivirales más potentes contra B.1.1.7 y BetaCoV / Australia / VIC01 / 2020 (VIC) a concentración nM (Figura 3 B y y C),C), pero los tres fármacos suprimieron eficazmente la replicación de ambos virus (Figura 3 B,,CC,,MImi,,FF,, HH,,YOyo).
Replicación viral en células epiteliales de pulmón humano Calu-3 de SARS-CoV-2 BetaCoV / Australia / VIC01 / 2020 (VIC) o SARS-CoV-2 B.1.1.7 (SARS CoV 2 England / ATACCC 174/2020) después del tratamiento con dosis crecientes de plitidepsina inhibidor de eEF1A, ralimetinib inhibidor de p38 o remdesivir inhibidor de la replicación viral (n = 3). ( A , D , G ) La viabilidad celular en ausencia de infección después de la exposición a concentraciones de inhibidor indicadas se muestra en relación con los controles tratados con DMSO. ( B , E , H) Los niveles de infección después del tratamiento con plitidepsina (6 nM) (B), ralimetinib (6,7 μM) (E) o remdesivir (1,1 μM) (H) se midieron mediante tinción intracelular para la proteína de la nucleocápsida (N +) del SARS-CoV-2 en 24 horas después de la infección. El porcentaje de infección se muestra en relación con los controles tratados con DMSO (n = 2–3). ( C , F , I ) Se muestra la replicación de ARN E genómico y subgenómico del SARS-CoV-2 por μg de ARN total medido por qRT-PCR. Las líneas discontinuas indican la replicación viral en presencia de control de vehículo DMSO. Media +/− SEM (n = 3).
En conjunto, los fármacos dirigidos por el huésped plitidepsina y ralimetinib, así como el remdesivir, poseen eficacia antiviral tanto contra el linaje temprano (VIC) del SARS-CoV-2 como contra la variante del virus B.1.1.7. La plitidepsina es un tratamiento clínico aprobado para el mieloma múltiple ( Leisch et al., 2019 ) y actualmente se encuentra en un ensayo clínico de fase 2 para el tratamiento de COVID-19 en España ( https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04382066 ) , debido a sus propiedades antivirales en cultivos celulares y modelos animales de enfermedad. En consonancia con los datos anteriores, hemos demostrado recientemente que plitidepsin es 27,5 veces más potente contra SARS-CoV-2 de principios del linaje de remdesivir y ejerce actividad antiviral con un IC 50 de aproximadamente 1 nM ( White et al., 2021). La plitidepsina es un antagonista de eEF1A, que forma parte del complejo de elongación de traducción eucariota 1 y comúnmente utilizado por los virus de ARN para la traducción de ARNm ( Li et al., 2013 ). Por lo tanto, el tratamiento con plitidepsina puede interferir con éxito con la replicación viral y podría extenderse a otras infecciones virales como un antivírico de acción amplia, lo que sería consistente con informes anteriores que sugieren que los virus son más susceptibles a los reguladores de la proteostasis que sus huéspedes celulares ( Heaton et al. al., 2016 ).
Ralimetinib, un inhibidor de la proteína quinasa activada por mitógenos p38, se desarrolló inicialmente para el tratamiento de pacientes con cáncer avanzado ( Patnaik et al., 2016 ; Vergote et al., 2020 ). p38 está involucrado en diferentes procesos celulares que incluyen la traducción de proteínas, el ciclo celular, la inflamación y la muerte celular ( Zarubin & Jiahuai, 2005 ). Anteriormente informamos que p38-MAPK está fuertemente regulada durante la infección por SARS-CoV-2 y los medicamentos dirigidos a estas vías mostraron actividad antiviral in vitro., lo que sugiere que el SARS-CoV-2 se basa en la activación de p38 para la replicación viral. Se han informado hallazgos similares para SARS-CoV y HCoV-229E, donde se observa la activación de p38 durante la infección viral y la inhibición de esta vía puede limitar la replicación viral ( Kono et al., 2008 ; Mizutani et al., 2004 ). Además, hemos demostrado que el bloqueo de la activación de p38 reduce significativamente la expresión de citocinas ( Bouhaddou et al., 2020 ), lo que sugiere que apuntar a esta vía puede ser beneficioso en casos graves de COVID-19, donde la desregulación inmune y el daño tisular se asocian con un mal pronóstico de la enfermedad .
Si bien las mutaciones en la proteína Spike en la variante B.1.1.7 podrían contribuir potencialmente a una mayor transmisibilidad, las mutaciones en otras proteínas virales también podrían estar influyendo. Será interesante determinar si estas mutaciones alteran el panorama de interacción proteína-proteína humana SARS-CoV-2-proteína humana y cómo lo hacen ( Gordon, Hiatt, et al., 2020 ; Gordon, Jang, et al., 2020 ). Además, el análisis de los cambios celulares en el huésped durante la infección con los diferentes linajes, incluida la monitorización de las alteraciones en las redes de señalización a través de modificaciones postraduccionales (es decir, fosforilación ( Bouhaddou et al., 2020 ) y ubiquitinación), así como las dependencias genéticas del huésped ( Daniloski et al. al., 2021 ; Wang et al., 2021 ;Wei et al., 2021 ), pueden ayudar a comprender estas y futuras variantes.
Este estudio se basa en nuestra caracterización previa de los medicamentos dirigidos al huésped como antivirales para la infección por SARS-CoV-2 ( Gordon, Hiatt, et al., 2020 ; Gordon, Jang, et al., 2020 ; Bouhaddou et al., 2020 ; White et al., 2021) y demostrar las ventajas de reutilizar medicamentos que están clínicamente aprobados con farmacocinética y perfiles de seguridad conocidos, ya que pueden pasar rápidamente a ensayos clínicos. Además, nuestros datos fomentan el desarrollo preclínico y clínico continuo de terapias antivirales dirigidas al huésped para COVID-19, ya que dirigirse a los factores esenciales del huésped necesarios para la replicación viral proporciona una estrategia para mantener la eficacia contra las variantes emergentes del SARS-CoV-2. Es importante destacar que, dado que estos medicamentos inhiben los procesos celulares comúnmente empleados por diferentes virus para asegurar la infección, estas y otras terapias dirigidas al huésped podrían usarse para responder rápidamente a futuros brotes virales.
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